Mutacja genu lipazy ludzkiej lipoproteinowej jako najczęstsza przyczyna rodzinnej chylomikronemii u francuskich Kanadyjczyków ad 5

MRNA przedstawiony na ścieżce oczyszczono z komórek COS-1 transfekowanych normalnym cDNA lipazy lipoproteinowej; na ścieżce 2, z komórek COS-1 transfekowanych zmutowanym cDNA Pro . Leu207, klon 1; na ścieżce 3 z komórek COS-1 transfekowanych zmutowanym cDNA Pro . Leu207, klon 2; i na ścieżce 4 z komórek COS-1 transfekowanych tylko wektorem i sondowanych fragmentem cDNA lipazy lipoproteinowej znakowanej 32P. Poziomy mRNA lipazy lipoproteinowej są obecne na równoważnych poziomach w ścieżkach 1, 2 i 3. Fagemid DNA z jednego normalnego klonu zawierającego cDNA lipazy lipoproteinowej typu dzikiego (kontrola pozytywna), dwa zmutowane klony niosące mutację Pro . Leu207 i klon wektora (kontrola negatywna) zostały oczyszczone i użyte do transfekcji komórek COS-1. Jak pokazano na Fig. 3, wskaźnikowy RNA lipoproteinowej lipazy (mRNA) (transkrypt o 2,4 kb) był obecny na podobnych poziomach w komórkach transfekowanych normalnym i zmutowanym cDNA. Nie było wykrywalnego mRNA lipazy lipoproteinowej w komórkach COS-1 transfekowanych samym wektorem, co wskazuje, że endogenna ekspresja lipazy lipoproteinowej przez komórki COS-1 była bardzo ograniczona.
Figura 4. Figura 4. Masa lipazy lipoproteinowej (panel A) i aktywność (panel B) w 12-godzinnej pożywce hodowlanej (stałe paski) i homogenat komórkowy (kreskowane kreski) komórek COS-1 transfekowanych cDNA lipazy lipoproteinowej normalnej i cDNA Mutant Pro . Leu207. Wyniki wyrażono jako procenty poziomów określonych w pożywce i homogenacie komórkowym komórek COS-1 transfekowanych normalnym cDNA lipazy lipoproteinowej. Rzeczywiste poziomy podano w nawiasach i wyrażono jako nanogramy na szalkę hodowlaną dla masy lipazy lipoproteinowej i jako nanomole wolnych kwasów tłuszczowych na minutę na szalkę dla aktywności.
Lipazę lipazy i aktywność lipazy lipoprotein oznaczano w pożywce transfekowanych komórek COS-1 oraz w homogenatach komórek zarówno dla normalnego, jak i zmutowanego cDNA. Białko lipazy lipoproteinowej było obecne w pożywce komórek transfekowanych zmutowanym cDNA, na poziomie 28 procent poziomu w normalnej kontroli (Fig. 4A). Jednak podobne poziomy masy lipazy lipoproteinowej wykryto zarówno w normalnym, jak i zmutowanym homogenacie komórkowym. Aktywność enzymatyczna wyrażonej zmutowanej lipazy lipoproteinowej w pożywce była bliska zeru, w porównaniu do normalnej aktywności eksprymowanej lipazy lipoproteinowej typu dzikiego (Fig. 4B). Dane te pokazują, że wydzielony zmutowany enzym jest nieaktywny katalitycznie.
Dyskusja
Na całym świecie niedobór lipazy lipoproteinowej występuje z najwyższą zgłaszaną częstością u francuskich Kanadyjczyków, wśród których przewidywana szybkość nosicielstwa wynosi na 40 w niektórych regionach Quebec.4. Zgłaszamy mutację missense w genie ludzkiej lipazy lipoproteinowej, która powoduje substytucję leucyny dla proliny przy reszcie 207 dojrzałego białka i która została znaleziona na 54 z 74 zmutowanych alleli (73 procent) u 37 niewyselekcjonowanych pacjentów z Kanady Francuskiej z niedoborem lipazy lipoproteinowej. W badaniach mutagenezy in vitro ukierunkowanej na miejsce wykazaliśmy, że ta substytucja wytwarza katalitycznie nieaktywne białko lipazy lipoproteinowej i jest przyczyną niedoboru lipazy lipoproteinowej u tych pacjentów.
Badania mutagenezy wykazały, że poziomy zmutowanego i mRNA lipazy lipoproteinowej typu dzikiego w transfekowanych komórkach COS-1 są podobne, podobnie jak poziomy lipazy lipoproteinowej związanej z komórkami
[podobne: szeridan, kuba staszkiewicz, anitech olsztyn ]