Mutacja genu lipazy ludzkiej lipoproteinowej jako najczęstsza przyczyna rodzinnej chylomikronemii u francuskich Kanadyjczyków ad

Do celów porównawczych włączono również 170 osób kontrolnych tego samego pochodzenia, które miały normolipidemię. Lipaza i aktywność lipazy lipoproteinowej
Próbki krwi pobierano od wszystkich pacjentów po całonocnym poście. Całkowity cholesterol, trójglicerydy i HDL oraz cholesterol lipoprotein o małej gęstości (LDL) mierzono zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami. 4, 20 Próbek krwi pobierano również po podaniu heparyny; Masę i aktywność lipazy lipoproteinowej mierzono w osoczu z obu zestawów próbek krwi, w pożywce komórkowej COS-1 i w próbkach homogenatu komórkowego, jak opisano wcześniej.
Analiza DNA
Genomowy DNA wyizolowano z białych komórek wszystkich probantów i niektórych członków rodziny.22 Haplotypy DNA zmutowanych alleli lipazy lipoproteinowej skonstruowano przy użyciu polimorfizmów z restrykcyjnymi fragmentami długości HindIII, BamHI i PvvII23, przy genie lipazy lipoproteinowej. umiejscowienie.
Do analizy sekwencji wybrano francuski proband z niedoborem aktywności lipazy lipoproteinowej i homozygotyczną pod względem najczęstszego haplotypu lipazy lipazy lipotropowej H2 (Hindlll +, BamHI -, PraII +), dla którego nie wykryto żadnej mutacji. Każdy z 10 eksonów kodujących sekwencję aminokwasową lipazy lipoproteinowej był indywidualnie amplifikowany z 0,5 do fig genomowego DNA z reakcją łańcuchową polimerazy, jak opisano wcześniej.19 Wzmocnione egzony następnie oczyszczono i zsekwencjonowano albo bezpośrednio, albo po klonowaniu do pUC18. wektor.
Hybrydyzacja oligonukleotydów amplifikowanego DNA
Egzon 5 genu lipazy lipoproteinowej ze wszystkich probantów i kontrolnych amplifikowano przez łańcuchową reakcję polimerazy, a około 50 ng DNA denaturowano i przenoszono w dwóch powtórzeniach na membrany nylonowe (Hybond N-plus, Amersham). Oligonukleotydy homologiczne do normalnych i zmutowanych sekwencji obejmujących podstawienie Pro . Leu207 zsyntetyzowano na zautomatyzowanym syntetyzerze DNA (model 380A, Applied Biosystems) i ostatecznie znakowano [r-32P] ATP. Hybrydyzację oligonukleotydów przeprowadzono jak opisano uprzednio, 19, 20 z następującymi modyfikacjami. Hybrydyzację przeprowadzono w buforze zawierającym procent albuminy surowicy bydlęcej, 0,5 mola fosforanu sodu na litr (pH 7,2), mmol EDTA na litr (pH 8,0) i 7 procent dodecylosiarczanu sodu, w którym każdy oligonukleotyd w x 106 zliczeń na minutę na mililitr inkubowano przez dwie godziny w 48 ° C. Filtry płukano w kilku buforach w następujących warunkach: w buforze (2 x SSPE, 0,5 procentowy dodecylosiarczan sodu) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, w buforze 2 (1 x SSPE, 0,25 procentowy dodecylosiarczan sodu) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. temperaturę pokojową, i w buforze 3 (0,1 x SSPE i 0,1% dodecylosiarczan sodu) przez 30 minut w 42 ° C dla zmutowanego oligonukleotydu i w temperaturze 43 ° C dla sondy typu dzikiego (1 x SSPE oznacza 150 mM chlorek sodu, 10 mM fosforanu sodu i mM EDTA).
Mutageneza ukierunkowana na cDNA lipazy lipoproteinowej
Fragment cDNA obejmujący całą sekwencję kodującą (nukleotydy 61 do 1642), flankowaną przez 113 bp (pary zasad) 5 do kodonu inicjacyjnego i 40 pz 3 do kodonu terminacji, przygotowano z pełnej długości klonu cDNA lipazy lipoproteinowej. (pLPL35)
[patrz też: szeridan, kuba staszkiewicz, dorota gwiazdowska ]