Mutacja genu lipazy ludzkiej lipoproteinowej jako najczęstsza przyczyna rodzinnej chylomikronemii u francuskich Kanadyjczyków cd

Fragment ten wklonowano do wektora Bluescript KSII + (Stratagene), ponownie zbadano i zligowano z wektorem fagemidowym CDM8,25, który służył jako wektor dwufunkcyjny do mutagenezy i ekspresji. Mutagenezę in vitro przeprowadzono zgodnie ze zmodyfikowaną metodą podwójnego dupleksowego DNA. DNA matrycy do mutagenezy wytworzono przez hybrydyzację zlinearyzowanego i zdenaturowanego DNA wektora CDM8 z jednoniciowym DNA matrycy CDM8-lipoproteinowej. Końcowym produktem jest dwuniciowa matryca DNA zawierająca jednoniciową przerwę cDNA lipazy lipoproteinowej do mutagenezy. Ten DNA z podwójnym dupleksem został wygrzany 17-nukleotydowym mutagennym starterem (5 CATTTACCTGAATGGAG3 ) i wypełniony polimerazą DNA T4 (Pharmacia). Zmutowane klony zidentyfikowano przez hybrydyzację oligonukleotydów i zweryfikowano przez sekwencjonowanie DNA. Przejściowa ekspresja w komórkach COS-1
Fagemidy ekspresyjne wprowadzono do komórek COS-1 przez elektroporację, jak opisano w innym miejscu 19 (COS-1 [CV-1, pochodzenie SV40] to permisywna linia komórkowa otrzymana przez transformację małpich komórek CV-1 z SV40 z niewiadomego pochodzenia genom.) Transfekowane komórki umieszczano na płytkach o średnicy 100 mm, z których każda zawierała 10 ml pożywki zawierającej 40 fig heparyny na mililitr i inkubowano przez 48 godzin. Po zmianie pożywki i dalszej inkubacji przez 12 godzin pożywkę hodowlaną usunięto, natychmiast zamrożono w porcjach po ml i przechowywano w -70 ° C. Komórki zliczono i zebrano w celu izolacji RNA i przygotowania homogenatów komórkowych.
Wyniki
Analiza DNA
Tabela 1. Tabela 1. Haplotypy lipazy lipidowej lipoprotein związane z mutacjami DNA w 22 francuskich kanadyjskich probandach z niedoborem lipazy lipoproteinowej. Rysunek 1. Rysunek 1. Sekwencje DNA nici kodującej z Exon 5 francuskiego pacjenta z Kanady z niedoborem lipazy lipoproteinowej i kontrolą normalną. Badanie komplementarnej sekwencji kodującej pacjenta ujawniło przejście C-to-T w drugiej pozycji kodonu 207, powodujące zastąpienie leucyny proliną.
Byliśmy w stanie skonstruować haplotypy DNA dla zmutowanych alleli u 22 spośród 37 francuskich pacjentów z kanadyjskim niedoborem lipazy lipoproteinowej (Tabela 1). Większość z tych pacjentów okazała się być homozygotami pod względem haplotypu H2. Analiza sekwencji eksonu 5 od jednego z tych osobników ujawniła homozygotyczność dla przejścia C-to-T przy nukleotydzie 875 opublikowanej sekwencji cDNA lipazy lipoproteinowej (Fig. 1). Ta mutacja powoduje substytucję aminokwasową leucyny (CTG) dla proliny (CCG) w reszcie 207. Zarówno kodujące, jak i niekodujące nici DNA eksonu 5 z kilku niezależnych reakcji łańcuchowych polimerazy zsekwencjonowano w celu potwierdzenia obecności mutacji Pro . Leu207 . Nie wykryto żadnej innej zmiany DNA w eksonie 5 i stwierdzono, że sekwencja DNA dziewięciu pozostałych egzonów i połączeń egzon-intron genu lipazy lipoproteinowej jest normalna. Ponieważ ta mutacja z jedną zasadą nie zmienia miejsca restrykcyjnego, została oceniona u innych pacjentów za pomocą analizy hybrydyzacji swoistej dla oligonukleotydu allelowego.
Wykazano, że haplotyp H1 jest związany z mutacją w pozycji 188 białka lipazy lipoproteinowej, co powoduje substytucję kwasu glutaminowego dla glicyny.
[hasła pokrewne: zdz słupsk, clemastinum syrop, piperyna forte cena ]